Die Geschichte von Mass Effect 2 setzt einen Monat nach den Ereignissen des ersten Teils ein. Der Citadel-Rat ist genauso engstirnig wie zuvor und lässt die gesamte Allianz-Streitmacht, einschließlich der Normandy Geth bekämpfen, statt den wahren Feind, die Reapern, aufzuspüren. Während einer routinemäßigen Suche nach den Geth wird die Normandy von einem unbekannten, organischen Schiff angegriffen. Commander Shepard gelingt es gerade noch die Crew in die Rettungskapseln zu schicken, bevor die Normandy vom Feind zerstört wird und der Commander bewusstlos ins All treibt.

Zwei Jahre später erwacht Commander Shepard in der Lazarus-Station von Cerberus. Das private Unternehmen hat viel Zeit und Geld investiert, den Helden der Allianz zurück ins Leben zu holen. Ihr Anführer, ein geheimnisvoller Mann mit dem Titel "der Unbekannte", möchte die Reaper eindeutig vernichten. Doch seine genauen Motive sind undurchsichtig. Der Unbekannte baut Shepard ein neues Schiff, die Normandy SR2 und schickt ihn auf die Suche nach den Reapern und deren neuen Untertanen, den Kollektoren. Beim Angriff der Kollektoren auf die Menschen-Kolonie auf Horizon, versucht Commander Shepard einzugreifen, kann aber nur noch mit ansehen, wie die Bewohner in Stase abtransportiert werden. Kurz darauf fängt der Unbekannte ein Funksignal der Turianer ab, die von einem inaktivem Kollektoren-Schiff berichten. Der Commander geht an Bord und findet dort heraus, dass die Kollektoren einst die Protheaner waren. Sie wurden von den Reapern nicht getötet, sondern genetisch modifiziert. Nun sind sie die perfekten organischen Krieger und das genaue Gegenstück der Geth. Beinahe Zeitgleich muss Shepard feststellen, dass das Kollektoren-Schiff gar nicht deaktiviert, sondern eine Falle ist! Um Haaresbreite gelingt Shepard die Flucht.

Aber das Wissen über den Verbleib der Protheaner ist nicht das Einzige, was Commander Shepard erfährt. Die Basis der Kollektoren und somit eines weiteren Reapers ist nur über das Omega-4-Portal zu erreichen. Jedes Schiff, das dort hindurch sprang wurde bislang vernichtet, weil ihnen das entsprechende Freund-Feind-Erkennungssignal fehlte. Aus dem Wrack des alten Reapers kann die Crew der Normandy das FFS bergen und springt damit durch das neuartige Portal. Dank zahlreicher technischer Upgrades gelingt es der Normandy das Kollektoren-Schiff im zweiten Kampf zu zerstören und auf der Kollektoren-Basis zu landen. Dort muss Shepard mit ansehen, wie die entführten menschlichen Siedler zu einer biologischen Masse verarbeitet werden, um aus ihnen einen neuen Reaper zu erschaffen. Ein Reaper, der durch seine biologische Grundlage eine gigantische humanoide Form annimmt. Glücklicherweise gelingt es Commander Shepard den Reaper vor seiner endgültigen Fertigstellung zu vernichten. Eigentlich will er die Kollektoren-Basis ebenfalls sprengen, doch der Unbekannte bittet den Commander sie zu Forschungszwecken lediglich zu sterilisieren.